Nụ cười của Mona Lisa đã trở thành một trong những đặc điểm nổi bật nhất của bức tranh. Nụ cười này đã được miêu tả là "huyền bí", "lôi cuốn" và thậm chí là "bí mật". Nhiều người đã cố gắng giải thích ý nghĩa của nụ cười này, từ việc cho rằng nó là một dấu hiệu của hạnh phúc và sự thỏa mãn đến việc cho rằng nó là một dấu hiệu của sự buồn bã và ẩn sĩ.